Het ontstaan van meercellige organismen wordt beschouwd als één van de belangrijkste stappen in de evolutie van het leven. Om de overgang te kunnen maken van onafhankelijke eencelligen naar functionele eenheden van meercellige organismen moesten manieren ontwikkeld worden om samen te werken en te communiceren over grotere afstanden. In dit proefschrift proberen we te ontrafelen hoe zulke samenwerking en communicatie tot stand gebracht kan worden.
De drie belangrijkste groepen van meercellige organismen, namelijk de planten, de dieren en de schimmels, ontstonden zo'n 540 miljoen jaar geleden, aan het begin van het Cambrium. Deze groepen bestuderen we in dit proefschrift echter niet; in plaats daarvan richten we ons op de slijmschimmel (Dictyostelium discoideum). Deze eencellige verandert namelijk ook af en toe in een meercellig organisme, en doordat dit proces zeer gedetailleerd bestudeerd kan worden, is er veel over deze overgang bekend. De slijmschimmel komt algemeen voor in de bossen, waar hij als een eencellige amoebe rondkruipt en leeft van de bacteriën die de gevallen bladeren verteren. Wanneer echter alle bacteriën verorberd zijn, verandert het gedrag drastisch: rond de 100.000 cellen verzamelen zich en vormen een soort slakje, circa 1 mm lang. Dit slakje baant zich een weg naar de oppervlakte, door gebruik te maken van informatie uit de omgeving, zoals bijvoorbeeld lichtinval en temperatuurverschillen. Eenmaal aan de oppervlakte transformeert het slakje zich in een een soort van paddestoeltje, dat circa 6 mm hoog wordt. Dit vruchtlichaampje bestaat uit een een sporeknopje bovenop een lang en smal toelopend steeltje.
De belangrijkste manier waarop de cellen met elkaar communiceren is door middel van het molecuul cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP). Sommige van de amoeben stoten cAMP uit, en de amoeben die zich in hun nabijheid bevinden reageren op deze stimulatie door cAMP door middel van (i) een toename in cAMP productie en een daarop volgende uitstoot van cAMP, en (ii) een beweging in de richting van een hogere concentratie cAMP. De cAMP receptoren, die zich in het membraan van de amoeben bevinden, worden na stimulatie ongevoelig, waardoor deze reacties worden beëindigd. De cAMP wordt vervolgens afgebroken, waarna de amoeben opnieuw gestimuleerd kunnen worden. Op deze manier kunnen de cellen het cAMP signaal doorgeven, waardoor golven van cAMP worden gevormd waarmee over grotere afstand gecommuniceerd kan worden. Deze manier van doorgeven van signalen valt onder de klasse der exciteerbare media. Het concept `exciteerbare media' is een belangrijk concept in de theoretische biologie. Het beschrijft ruimtelijke systemen die aan twee voorwaarden voldoen en als gevolg daarvan bepaalde patronen opleveren. Die voorwaarden zijn het vermogen om prikkels door te geven, en het vermogen om zich na een korte tijd van het doorgeven van deze prikkels te herstellen. Gedurende deze herstelperiode is het medium ongevoelig voor prikkels. Vaak wordt een exciteerbaar medium beschreven in termen van een activerende en een remmende substantie. Exciteerbare media produceren een enorme verscheidenheid aan patronen. De twee meest elementaire patronen zijn golven die zich vanuit een puntbron uitbreiden (zoals bijvoorbeeld de golven die het samentrekken van het hart aansturen), en golven die de vorm aannemen van een spiraal die zichzelf in stand kan houden (zulke spiralen worden bijvoorbeeld vaak waargenomen wanneer de amoeben van de slijmschimmel zich verzamelen).
In deel I van dit proefschrift onderzoeken we het algemene probleem van complexe patroonvorming in exciteerbare media. In hoofdstuk 2 onderzoeken we een mechanisme waardoor spiralen kunnen uiteenvallen. Het wordt algemeen aangenomen dat hartfibrillatie en hartstilstand worden veroorzaakt door het ontstaan en uiteenvallen van spiralen. Het uiteenvallen van spiralen wordt ook bestudeerd in de Belousov-Zhabotinsky (BZ) reactie, een chemisch proces dat zich gedraagt als een exciteerbaar medium.
We gebruiken een partieel differentiaalvergelijkingen (PDE) model voor exciteerbare media, zoals ontwikkeld door Panfilov & Pertsov (1984). In het algemeen beweegt een hol golffront zich sneller voort dan een bol golffront, doordat in het geval van een hol golffront de hoeveelheid activerende substantie vlak voor de golf sneller toeneemt. Daardoor wordt dit stukje medium sneller geactiveerd. Deze relatie tussen voortbewegingssnelheid en kromming wordt de `eikonal-curvature' relatie genoemd. Door de invloed van de kromming hebben golffronten de neiging een gladde vorm te behouden: ze zijn, zoals dat dat heet, lateraal stabiel. Wij onderzoeken de situatie waarbij de remmende substantie harder diffundeert dan de activerende substantie. Bij ons onderzoek kan het effect dat een grotere hoeveelheid activator vlak voor een hol golffront heeft, teniet worden gedaan door de aanwezigheid van een nog grotere hoeveelheid inhibitor. In deze studie laten wij zien dat door een snelle diffusie van de inhibitor de `eikonal-curvature' relatie inderdaad negatief kan worden, wat betekent dat het golffront lateraal instabiel wordt en kleine rimpelingen worden opgeblazen. De spiraal kan hierdoor uiteindelijk uiteenvallen in vele spiraaltjes. Ons model kan zeer goed de patronen beschrijven die worden waargenomen in de BZ reactie, maar de resultaten zijn hoogstwaarschijnlijk veel breder toepasbaar.
In deel II van dit proefschrift ontwikkelen we een model dat de gehele levenscyclus van de slijmschimmel beschrijft en verklaart. Hiertoe gebruiken we in ons model verschillende modules, die elk een ander aspect van de ontwikkeling weergeven, en die op elkaar inwerken. De twee belangrijkste modules zijn het model voor exciteerbare media dat in deel I is geïntroduceerd, en het zogenaamde Glazier en Graner model, dat celverplaatsingen beschrijft ten gevolge van verschillen in adhesie tussen de cellen. Dit tweede model is een cellulaire automaat (CA), waarin een verzameling hokjes tezamen één amoebe beschrijft. Een amoebe verplaatst zichzelf langzaam over de CA, door zich steeds in een ander hokje uit te breiden. Of een amoebe zich uitbreidt of niet, wordt bepaald door een energieminimalisatie regel, die niet alleen de adhesie tussen cellen in beschouwing neemt, maar ook het totale volume van de cel, en de energie die het kost om een cel een beetje te verplaatsen. De twee bovenstaande modules zijn aan elkaar gekoppeld door aan de CA chemotaxis toe te voegen, en daarvoor de locale cAMP gradiënt uit de desbetreffende PDE te gebruiken.
In de hoofdstukken 3 en 4 onderzoeken we hoe de slijmschimmel zich als een slak voortbeweegt en hoe deze zich oriënteert aan de hand van temperatuurgradiënten en lichtinval, om zo de oppervlakte van de bodem te bereiken. Hoofdstuk 3 valt uiteen in twee delen. Het eerste deel beschrijft het voortbewegen van het slakje. Door middel van cAMP golven, die ontstaan aan de voorkant van de slak en vervolgens door het slakje heen bewegen, en de daarmee gepaard gaande chemotaxis naar cAMP toe, weten de modelslakjes voort te kruipen, met een snelheid die afhankelijk is van de grootte van het slakje. Tijdens dit voortbewegen behouden ze bovendien min of meer hun vorm. Deze resultaten zijn in overeenstemming met wat wordt waargenomen in in vivo experimenten. Daarnaast laten we zien dat, hoewel alle amoeben een even sterke chemotaxis vertonen, de cellen die uiteindelijk het steeltje zullen vormen naar voren uitsorteren, terwijl de uiteindelijke sporecellen daarachter terechtkomen. Hoewel dit verschil in gedrag veroorzaakt wordt door verschillen in adhesie, blijkt toch ook de chemotaxis essentieel voor het uitsorteren van de celtypen: aangezien beide processen afzonderlijk niet toereikend zijn om het uitsorteren van de celtypen te verklaren, is een combinatie van chemotaxis en differentiële adhesie nodig. Dit resultaat toont aan dat het belangrijk is om juist de interacties tussen verschillende processen in beschouwing te nemen.
In het tweede deel van dit hoofdstuk onderzoeken we hoe het slakje zich oriënteert volgens een temperatuurgradiënt. We laten zien dat dit gedrag van het slakje door ons model opgeleverd kan worden, ondanks dat de individuele amoeben niet in staat zijn om een temperatuurgradiënt te meten, en bovendien hun loopsnelheid niet afhangt van de temperatuur. In plaats daarvan veroorzaken temperatuurverschillen verschillen in de exciteerbaarheid van de cellen, wat vervolgens de vorm van de cAMP golf doet veranderen. Uiteindelijk draait het slakje naar de temperatuurgradiënt toe, als een gevolg van de chemotaxis naar de scheve cAMP golven. Het is erg frappant dat dit mechanisme zelfs blijft functioneren wanneer er extreem veel ruis door het signaal heen zit (de ruis kan zelfs 300 maal zo groot zijn als de gradiënt zelf). Dit komt doordat de golffronten als een gevolg van de hierboven beschreven invloed van de kromming hun gladde vorm neigen te behouden. Daardoor functioneren de golffronten als spatiaal-temporele ruisfilters, wat het mogelijk maakt om zowel zeer zwakke als zeer onregelmatige temperatuurgradiënten op te pikken.
In hoofdstuk 4 kijken we naar een andere eigenschap die het slakje naar de oppervlakte leidt, namelijk fototaxis. Om dit te kunnen onderzoeken voegen we een module toe die, door middel van de zogenaamde `ray-tracing' techniek, beschrijft hoe lichtstralen door het slakje worden verbogen. Bovendien beschrijven we het effect dat ammonia (NH3) heeft op de cAMP dynamica. We vinden dat als gevolg van de interacties tussen de verschillende modules, en tussen de individuele cellen, het slakje zich naar de lichtbron toekeert, terwijl de individuele cellen ook nu weer noch in staat zijn het signaal te detecteren (waar komt het licht vandaan?), noch een adequate reactie kunnen vertonen (bewegen richting de lichtbron).
Ons onderzoek heeft het volgende minimale mechanisme opgeleverd: doordat het slakje de lichtstralen breekt, en bovendien een min of meer ronde vorm heeft, verenigen de lichtstralen zich in een brandpunt dat zich bevindt aan de kant van het slakje dat van de lichtbron is afgericht. NH3 productie is hoger bij een hogere lichtintensiteit, en op zijn beurt vermindert NH3 de exciteerbaarheid van de cellen. Hierdoor lopen langs de zijde die van het licht is afgericht de cAMP golven langzamer, en worden de golven dus schreef getrokken. Wederom laat uiteindelijk de chemotaxis naar de cAMP toe het slakje draaien.
Dit model levert een interessant bijverschijnsel op, dat een extra validatie van ons model is: wanneer het slakje te gevoelig is voor NH3 kunnen de golven te schreef komen te liggen, en ontstaat er een torsiekracht die het slakje juist wegduwt uit de juiste richting. Daardoor gaat het slakje onder een bepaalde hoek ten opzichte van de lichtbron voortbewegen. Nu zijn er inderdaad mutanten beschreven die, net als onze modelslakjes, onder een bepaalde hoek ten opzichte van de lichtbron voortkruipen. Net zoals in ons model kan dit gedrag van deze zogenaamde `bi-directionele' mutanten verminderd of opgeheven worden door de NH3 rond het slakje te absorberen of de lichtintensiteit te verlagen.
De laatste twee hoofdstukken bestuderen het laatste stadium van de slijmschimmel, namelijk de culminatie, welke leidt tot de vorming van het het vruchtlichaampje. De celbewegingen tijdens de culminatie worden vergeleken met een ``omgekeerde fontein'': de uiteindelijke steelcellen, die zich in eerste instantie juist bovenaan bevinden, vormen een steeltje dat naar beneden beweegt en zich aan de bodem verankert, terwijl de uiteindelijke sporecellen daaromheen naar boven bewegen om het sporehoofdje te gaan vormen. In `leerboeken' wordt veronderstelt dat het steeltje naar beneden wordt gedrukt doordat bovenaan nieuwe steelcellen worden toegevoegd, en dat de sporecellen de lucht in worden getild door het groeiende steeltje. Echter, zowel ons model als verscheidene in vivo experimenten blijken deze mogelijkheid uit te sluiten.
Om de culminatie te onderzoeken breiden we in hoofdstuk 5 het model verder uit, met slijmmassa die de slijmschimmel omgeeft en met een stijve extracellulaire matrix die het steeltje omgeeft, de zogenaamde steelbuis. Ook voegen we celdifferentiatie toe, die onder invloed staat van een bepaald soort inductieproces. We laten zien dat het gehele proces van culminatie zich wél kan ontvouwen als een gevolg van de interacties tussen cAMP communicatie, variaties in adhesie, celdifferentiatie en de productie van extracellulaire matrices. We denken het proces op de volgende manier te kunnen verklaren: de periodieke opwaartse bewegingen naar de cAMP golven toe veroorzaken drukgolven, die op hun beurt weer peristaltische bewegingen in de punt van het steeltje veroorzaken. De peristaltische bewegingen `knijpen' het steeltje door de celmassa heen. Dit mechanisme leidt tot een lange, dunne steel, en bovendien stopt de neergaande beweging van het steeltje automatisch wanneer de bodem wordt bereikt, net zoals de omhooggaande beweging van de sporecellen automatisch stopt wanneer het steeltje af is. Nadat deze laatste beweging is gestopt, neemt het sporehoofdje een ronde vorm aan.
Dit mechanisme wat wij voorstellen heeft vele zelf-corrigerende eigenschappen; elke afwijking in de neerwaartse beweging van het steeltje wordt bijvoorbeeld direct gecorrigeerd. Ook zijn er veel in vivo experimenten in overeenstemming met ons mechanisme; het verklaart bijvoorbeeld waarom twee nabije vruchtlichaampjes zich altijd van elkaar africhten.
In hoofdstuk 6 kijken we nog gedetailleerder naar de mechanismen die leiden tot het vormen van het vruchtlichaampje. We onderzoeken de exacte voorwaarden waaraan de verschillende deelprocessen moeten voldoen, en hoe zij op elkaar inwerken. Om het steeltje te laten afdalen blijkt het niet voldoende te zijn om simpelweg een stijve steelbuis te hebben of, in plaats daarvan, een groep van zogenaamde padvindercellen rondom de punt van het steeltje. In plaats daarvan blijken beide nodig te zijn, omdat slechts door de interactie tussen de steelbuis en de padvindercellen een lange en smalle steel kan worden gevormd en de weerstand, veroorzaakt door de cellen die massaal omhoog bewegen, efficiënt verminderd kan worden, wat noodzakelijk is voor een snelle afdaling door de celmassa.
In dit hoofdstuk onderzoeken we ook alle voorwaarden voor de oppervlaktespanningen tussen de verschillende celtypen. Deze geven een indicatie voor de relatieve bindingssterktes die men verwacht aan te treffen in in vivo experimenten. Aan het einde van dit hoofdstuk proberen we een verband te leggen tussen bijverschijnselen van het model en experimentele observaties. Het lijkt daarnaast mogelijk om ons model te gebruiken om verklaringen te vinden voor de reeks van afwijkende fenotypen van mutanten, die tegenwoordig op grote schaal gecreëerd kunnen worden.
Ten slotte, de slijmschimmel Dictyostelium discoideum heeft bewezen een uitstekend paradigma te zijn voor het bestuderen van allerhande aspecten van de ontwikkeling van meercelligheid. Het is een uniek `model' organisme, dat ons in 48 uur de volledige overgang van eencelligheid naar meercelligheid kan laten zien. Een overgang die onvermijdelijk gepaard gaat met meercellige coördinatie en morfogenese. We hebben laten zien dat morfogenese in de breedste zin van het woord kan ontstaan uit de interacties en terugkoppelingen tussen een relatief klein aantal simpele bouwstenen, die duidelijk gedefinieerd zijn en goed begrepen worden. De eigenschappen van de bouwstenen die we gebruikt hebben zijn altijd in overeenstemming met wat in experimenten is gevonden, en de interacties die we hebben beschreven zijn altijd lokaal. We hebben laten zien dat om van (sub)cellulaire interacties tot een gecoördineerd meercellig gedrag te komen, dat in staat is tot het waarnemen van en het reageren op de omgeving, de slijmschimmel gebruik maakt van patronen in ruimte en tijd. Zulke patronen zijn, vergeleken met de kleine individuele amoeben, meer dan levensgroot. Ze worden gevormd door de interacties tussen de verschillende processen en gebruikt voor de terugkoppeling tussen de verschillende organisatieniveaus. Hoewel daardoor echter uiteindelijk zeer complexe processen plaatsvinden, is het toch nog mogelijk om de onderliggende mechanismen te ontrafelen. Ons model staat dat toe, doordat we kunnen kijken naar het gedrag op niveaus die liggen tussen het (sub)cellulaire niveau en het niveau van het volledige organisme in.